Responsável: Luciana Costa
Financiamento e data: INSA, Tese de Doutoramento de Liliana Marques (2006-).
Introdução: A ceruloplasmina (Cp) é uma α2-glicoproteína de fase aguda com um potencial papel na protecção contra o stress oxidativo. Estudos anteriores mostram a existência de duas formas moleculares distintas desta proteína: cp segregada (Cp s) e cp membranar via âncora glicosilfosfatidilinositol (Cp gpi). A Cps encontra-se predominantemente no plasma, atribuindo-se a sua síntese maioritariamente ao fígado enquanto a Cp gpi é expressa principalmente a nível do sistema nervoso central. A função fisiológica da Cp ainda não está completamente esclarecida, embora ambas as suas formas moleculares pareçam ter um papel determinante na oxidação e mobilização de ferro (Fe) nos tecidos em que são expressas, bem como uma função antioxidante. Resultados obtidos recentemente pelo nosso grupo de trabalho demonstram que linfócitos do sangue periférico (PBL) de humanos sintetizam Cp de novo e sugerem a existência nestas células das duas formas moleculares da Cp anteriormente reportadas. Neste contexto, coloca-se a hipótese de uma potencial associação funcional entre o sistema imunitário, o metabolismo do Fe e o stress oxidativo. Contudo, a função fisiológica da Cp linfocitária (PBLCp) e os mecanismos subjacentes à regulação da sua expressão continuam por esclarecer.
Objectivos: O objectivo principal deste trabalho consiste no esclarecimento dos mecanismos moleculares de regulação da expressão da ceruloplasmina linfocitária. Especificamente, pretende-se:
1. Estudar o efeito de potenciais moduladores da expressão das diferentes formas moleculares de PBLCP.
2. Investigar a potencial co-localização e interacção da PBLCP com outras proteínas à superfície dos PBL.
3. Contribuir para o esclarecimento da função fisiológica da PBLCP.
Materiais e métodos: Neste âmbito, são propostas as seguintes estratégias:
A. O estudo dos mecanismos implicados na regulação síntese da PBLCP será feito através das técnicas de cultura celular na presença/ausência de potenciais moduladores (citocinas, indutores de activação linfocitária, metais e quelantes). A quantificação do efeito na expressão das várias formas da PBLCP, será feita através das seguintes metodologias:
i) Síntese de cDNA e PCR em tempo real (quantificação do mRNA celular das diferentes formas moleculares da PBLCP);
ii) Técnicas de Citometria de Fluxo (quantificação da expressão da proteína à superfície das células)
iii) Técnicas de Imunoprecipitação e Imunoblotting (quantificação da proteína síntetizada e segregada para o meio extracelular).
B. A investigação da co-localização e interacção da PBLCP com outras proteínas linfocitárias será realizada através de:
i) Técnicas de Imunocitoquímica e análise por Microscopia Confocal para o estudo da co-localização;
ii) Técnicas de Co-imunoprecipitação e Imunoblotting para o estudo da interacção.